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超実践バイオ実験イラストレイテッド レッスン2

シリーズ:
細胞工学  > 細胞工学別冊

細胞工学別冊  超実践バイオ実験イラストレイテッド レッスン2 

著:
西方敬人(甲南大学理工学部生物学科/甲南大学先端生命工学研究所(FIBER))
真壁和裕(徳島大学総合科学部自然システム学科)
頁数:
212ページ
定価:
4,180円(税込)
発行年月:
2006年12月15日発行
ISBN_10:
4-87962-347-4
ISBN_13:
978-4-87962-347-8

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第1章 定量的RT-PCR
1 半定量的RT-PCR
 1-1 逆転写
 1-2 サイクル数の検討
 1-3 異なる試料のPCR
 1-4 定量(オプション)
2 競合的(competitive)PCR法
 2-1 内部コントロールの競合的PCRによるRNA量の補正
 2-2 Competitor DNAの作製
 2-3 競合PCR
3 リアルタイムPCR
 3-1 SYBR Green I法
 3-2 TaqMan法
 <コラム>リアルタイムPCRを用いた定量の解析例

第2章 whole-mount in situハイブリダイゼーション
1 概要
 1-1 in situハイブリダイゼーション(ISH)
 1-2 whole-mount in situハイブリダイゼーション(WISH)
 1-3 InSituチップ
 1-4 プローブ
 1-5 固定
2 サンプルの固定
3 プローブ合成
 3-1 テンプレート調製
 3-2 RNA合成
 3-3 合成したプローブの定量
4 ハイブリダイゼーション
 4-1 固定サンプルのエタノールダウンシリーズ
 4-2 InSituチップのセットアップ
 4-3 染色

第3章 SDS電気泳動とウエスタンブロッティング
1 SDS電気泳動
 1-1 サンプル調製
 1-2 泳動槽のセットアップ
 1-3 サンプルの注入
 1-4 泳動の開始
 1-5 泳動の終了
 1-6 後片付け
2 ゲルの染色と乾燥
 2-1 ゲルの染色・脱色
 2-2 ゲルの乾燥
3 ウエスタンブロッティング
 3-1 PVDFメンブレンのプレウエッティグ
 3-2 ブロッティング
 3-3 後片付け
4 CBBによるメンブレンの染色
5 免疫染色
 5-1 ブロッキング
 5-2 一次抗体
 5-3 一次抗体の洗浄
 5-4 二次抗体
 5-5 二次抗体の洗浄
6 免疫染色の検出
 6-1 AP/BCIP(発色反応による検出)
 6-2 HRP/ECL(化学発光による検出)
 <コラム>SYPRO染色

第4章 融合タンパク質発現プラスミドの構築
1 融合タンパク質作製のためのプロトコール作成
2 発現系の選択
 2-1 大腸菌での発現系
 2-2 大腸菌以外での発現系
3 GST融合タンパク質発現プラスミドの構築
 3-1 GSTタグとは
 3-2 GSTタグ配列を持つベクター
 3-3 抗原タンパク質
 3-4 方針
 3-5 PCRプライマーの設計
<参考> タグ配列とは

第5章 融合タンパク質の大腸菌での発現

1 大腸菌の培養および発現誘導条件の検討
2 融合タンパク質分画の確認
3 大腸菌の大量培養と発現誘導
4 融合タンパク質分画の回収
 4-1 培養上清に分泌される場合
 4-2 ペリプラズムに分泌される場合
 4-3 大腸菌内にありPBSで可溶化できる状態になっている場合
 4-4 大腸菌内にありPBSで可溶化できないがインクルージョンボディーではない場合
 4-5 大腸菌内にありインクルージョンボディーになっている場合
5 アフィニティーレジンでの精製
 5-1 レジンへの吸着
 5-2 アフィニティーレジンの洗浄
 5-3 レジンからの溶出
 5-4 タグ配列の切断

第6章 免疫沈降とpull downアッセイ
1 目的分子の可溶化
 1-1 細胞のホモジェナイズ
 1-2 目的分子を含む分画の確認
2 免疫沈降操作
 2-1 プロテインGセファロースへの抗体の吸着
 2-2 抗体結合後のレジンの洗浄
 2-3 目的分子を含む分画との反応
 2-4 目的分子結合後のレジンの洗浄
 2-5 結果の判定
3 pull downアッセイ

第7章 培養細胞とトランスフェクション
1 培養細胞
2 培養細胞を扱う際に必要な無菌操作
3 無菌操作の注意事項
 3-1 培養室の環境整備
 3-2 クリーンベンチ内の環境維持
 3-3 実験者の清浄性の維持
 3-4 クリーンベンチ内での作業中
4 浮遊細胞の培養
 4-1 解凍
 4-2 継代培養(植え継ぎ)
 4-3 凍結保存
5 付着細胞の培養
 5-1 解凍
 5-2 継代培養(植え継ぎ)
 5-3 培地交換
 5-4 凍結保存
6 遺伝子導入試薬による形質転換
7 エレクトロポレーションによる形質転換

第8章 ルシフェラーゼアッセイ
1 ルシフェラーゼアッセイでできること
 1-1 遺伝子のエンハンサー/プロモーターのシス解析
 1-2 転写因子のドメイン解析
 1-3 DNA結合ドメイン解析
 1-4 siRNAの活性の検定
 1-5 翻訳を制御するRNA結合タンパク質の解析
 1-6 非常に弱いプロモーターをもつ遺伝子の生体内での発現をモニターする
 1-7 細胞内の微量な酵素の活性を定量する
 1-8 two-hybridアッセイ
2 ベクターと基質の選択
 2-1 コントロールの選択
 2-2 フラッシュアッセイかグローアッセイか
 2-3 転写の時間的変化や刺激反応性をみたい場合
 2-4 生きた細胞で継続的にリアルタイム測定をしたい場合
3 Dualルシフェラーゼアッセイによる活性の測定

第9章 two-hybrid法
1 3つのシステムの比較
 1-1 大腸菌
 1-2 酵母
 1-3 培養細胞
2 大腸菌ベースのtwo-hybrid法
 2-1 ベイトの準備
 2-2 ライブラリーの準備
 2-3 スクリーニング
3 酵母ベースのtwo-hybrid法
 3-1 コンベンショナルなtwo-hybridシステム
 3-2 CytoTrapシステム
4 動物細胞ベースのtwo-hybrid法

第10章 バイオインフォマティクスの初歩
1 塩基配列の処理と情報検索
 1-1 塩基配列の加工
 1-2 少数のファイル間での配列比較
 1-3 比較したい配列を検索する
 1-4 ウェブ上のデータベースを使った配列データ解析の初歩
 1-5 ウェブ上のツールを使った塩基配列データ解析の初歩
2 既存の塩基配列,アミノ酸配列等のデータベースを利用する解析の初歩
 2-1 ゲノムデータベースを利用する
 2-2 ゲノムデータと実験データをともに利用した実験例
 2-3 cDNAデータベースを利用する
 2-4 大量データからのマイニング
3 ウェブを利用した文献検索の初歩
 3-1 単純なキーワードサーチ
 3-2 検索式を用いた組み合わせ検索
 3-3 BioMailによる関連論文の自動検索

第11章 バイオ実験に関連する法律と規制
1 カルタヘナ法
 1-1 安全取り扱いの配慮が必要な理由
 1-2 カルタヘナ法は何を規制しているか
 1-3 使用等にはどのようなものが含まれるか
 1-4 遺伝子組換え実験計画書
 1-5 拡散防止措置と物理的封じ込め(physical containment)
 1-6 保管にあたって執るべき措置
 1-7 運搬にあたって執るべき措置
 1-8 譲渡をするとき,されるときに執るべき措置
 1-9 輸出入にあたってとるべき措置
<コラム> 法令と各研究機関の規則
2 その他の生命科学実験の安全や倫理問題
 2-1 生命倫理に関する問題点
 2-2 ライフサイエンスにおける安全に関する問題点

付録 試薬の組成・調製法と遺伝子組換え実験の表示例
1 試薬の組成と調製法
 1-1 一般的な試薬
 1-2 細胞培養培地用の試薬
 1-3 細胞培養培地の作製
2 遺伝子組換え実験の表示