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バイオ実験イラストレイテッド④ 電子版

細胞工学別冊  バイオ実験イラストレイテッド④ 電子版 苦労なしのクローニング

著:
真壁和裕(京都大学大学院理学研究科)
頁数:
226ページ
発行年月:
1997年06月01日発行

1.cDNAライブラリーの作製
2.ゲノムライブラリーの作製
3.ファージの増殖とDNAの調製
4.ハイブリによるスクリーニング
5.発現スクリーニング


第1章 cDNAライブラリーの作製
1.cDNAライブラリー作製の流れ
2.ポリ(A)セレクション
 RNAサンプルのproteinaseK処理
 オリゴ(dT)セルロースカラムによるポリ(A)セレクション
 コラム:DEPC処理
 オリゴテックス(dT)30によるポリ(A)セレクション
3.cDNAの合成
 cDNA合成の流れ
 どのようなcDNAライブラリーを作製するか
 逆転写反応
 逆転写反応の実際
 逆転写反応の効率チェック
 コラム:効率チェックの原理
 平滑末端を持つ2本鎖DNAの合成
 2本鎖DNAの末端処理
 アダプターの付加
 アダプターの末端リン酸化
 コラム:アダプターの自作法
 アダプタープライマーの切断
 カラムクロマト法によるサイズ分画化
 non-RIでのcDNA濃度のチェック
4.ベクターの選択とライゲーション
 ベクターとのライゲーション
 λファージのパッケージング
 ライブラリーのチェック
 ライブラリーのタイター測定
 コラム:タイターの算出
 PCRを使ったインサートサイズのチェック

第2章 ゲノムライブラリーの作製
1.ベクターの準備
2.ゲノムライブラリー用高分子DNAの抽出
 DNAの抽出
 DNAの濃縮
3.DNAの限定分解
 パイロット実験
 限定分解
4.ベクターへの組込み
5.ライブラリーのサイズと増幅

第3章 ファージの増殖とDNAの調製
1.スモールスケールでの増殖とDNA調製
 プレートライセート法
 ライブラリーの増幅
 コラム:ライブラリーの増幅と分注
 少量のファージからのDNA調製
2.ラージスケールでの増殖とDNA調製
 振盪培養法
 大量のファージからのDNA調製
3.invivoエキシジョン
 コラム:ヘルパーファージ

第4章 ハイブリによるスクリーニング
1.プラークリフティング
2.通常の条件下でのハイブリダイゼーション
 コラム:C0t1/2コラム:X線フィルムとプレート培地との照合
3.二次スクリーニング
4.ハイブリダイゼーションの条件の変更
5.オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション
 オリゴヌクレオチドプローブの調製
 コラム:ラジオアイソトープ(RI)の化合物の濃度
 ハイブリダイゼーション
6.ディファレンシャルスクリーニング法
 プラークリフティング
 ハイブリダイゼーション
 プローブの作製

第5章 発現スクリーニング
1.発現タンパク質のトランスファー
2.抗体を用いるスクリーニング(イムノスクリーニング)
3.結合DNAを用いるスクリーニング(リガンドスクリーニング)
 プローブのラベル
 DNAとタンパク質との結合