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バイオ実験イラストレイテッド⑦

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シリーズ:
細胞工学  > 細胞工学別冊
 |   細胞工学  > バイオ実験イラストレイテッド

細胞工学別冊  バイオ実験イラストレイテッド⑦ 使おう酵母 できるTwo Hybrid

著:
水野貴之(産業技術総合研究所)
頁数:
176ページ
定価:
本体3,500円(税別)
発行年月:
2003年10月30日発行
ISBN_10:
4-87962-265-6
ISBN_13:
978-4-87962-265-5


第1章 酵母の性質と培養法
1.酵母の性質と生育至適環境
 1-1 出芽酵母の基本的な性質と観察法
 1-2 酵母の生活環(life cycle)
2.酵母実験を行うために必要な実験器具
 2-1 インキュベーター(恒温槽)
 2-2 振とう機(恒温振とう機)
 2-3 遠心分離機
 2-4 ガスバーナー
 2-5 白金耳(接種棒)
 2-6 試験管類
 2-7 フラスコ
3.平板培地(シャーレ)による培養
 3-1 液体培養から平板培地への塗布
 3-2 平板培地で生育したコロニーから平板培地への塗布
 3-3 平板培地による培養
 3-4 シングルコロニーアイソレーション
 3-5 スポット法
4.嫌気培養
5.液体培地による培養
 5-1 菌体の保存法
 5-2 細胞濃度の測定法(生菌数)
6.培地の作製法
 6-1 平板培地の作製法
 6-2 液体培地の作製法
 6-3 基本的な培地の組成(1リットル あたり)
 6-4 酵母実験に用いる抗生物質・阻害剤
7.液体培養における増殖速度,世代時間の求め方

第2章 形質転換の理論と実験法
1.ポジティブスクリーニングの原理と形質転換頻度
2.遺伝子導入方法とベクター
3.酵母の形質転換法
 3-1 比較的簡便で多くの宿主を同時に用いる方法
 3-2 高頻度法の形質転換を行う場合
 コラム:マイクロピペッターは本当に正確か?
 3-3 凍結融解法
 3-4 コンラージ棒の作り方
4.形質転換後の培養法
 4-1 コロニーからの分離
 4-2 コンタミの早期発見と除去
 コラム:酵母の天敵はカビ,ヒトの天敵は酵母
5.遺伝子の破壊
 5-1 PCRを用いた遺伝子の破壊(置換)法
 5-2 置換の確認

第3章 two hybrid法によるスクリーニング
1.two hybrid法の基本的な理論
2.実際のスクリーニング手順
 2-1 レポーターシステムの決定およびDNA結合タンパク質の選定
 2-2 Baitベクターの作成と検定
 2-3 ライブラリーの導入
 2-4 ポジティブスクリーニング
 2-5 形質転換体の取得
 2-6 シングルコロニーの取得
 2-7 単独の形質転換体の取得
 2-8 プラスミドシャッフル
 2-9 Baitの欠失した細胞が要求性となることの確認
 2-10 プラスミドの回収
 2-11 再現性の確認
 2-12 塩基配列の決定
 2-13 ウェスタンブロット法によるBaitタンパク質の確認
 2-14 lac Z活性の定量化
 2-15 コロニーPCRおよびダイレクトシークエンス
3.二倍体を用いたスクリーニング法
4.two hybrid法の応用
 4-1 結合領域の同定
 4-2 ウラシルおよびリジンの前駆体アナログを使った結合の弱くなった変異のスクリーニング
 4-3 dual bait two hybrid法
 4-4 three hybrid法および条件付加two hybrid法
 4-5 RNAをBaitとしたthree hybrid法
 4-6 one hybrid法によるDNA結合タンパク質の取得

第4章 平板培地のレプリカ法
1.レプリカ法
 1-1 レプリカ布の作製
 1-2 レプリカの方法
2.レプリカ法による二倍体の作成

第5章 酵母からのDNAの調製
1.ガラスビーズを用いた方法
2.酢酸カリウム法
3.ハーホード(Hereford)法

第6章 酵母からの全RNAの調製
1.ガラスビーズを用いた方法
2.ホットフェノール法
3.ポリ(A)+RNAの調製

第7章 酵母の遺伝学とその他の応用法
1.5-FOAおよびα-アミノアジピン酸の利用法
 1-1 5-FOA
 1-2 α-アミノアジピン酸
2.二倍体の作製と胞子形成
 2-1 二倍体の作製
 2-2 胞子形成
3.出芽酵母の変異株の取得
 3-1 スクリーニングの方法
 3-2 EMS変異による変異株の分離
 3-3 優性劣性試験
 3-4 相補性試験
4.四分子分析
5.データの解析
6.ランダムスポアー
7.優性変異遺伝子のクローニング
 7-1 クローニングした遺伝子と変異遺伝子が同一であることの証明
 7-2 変異株を用いた遺伝子のクローニング
 7-3 最小相補領域の限定
8.平板上における酸性ホスファターゼ(rAPase)活性染色
 8-1 液体培地におけるrAPase活性測定
 8-2 rAPase 活性の定量化
9.酵母から特定の遺伝子を取得する方法
10.酵母の相同組換えを用いたプラスミド構築法
11.ヒドロキシルアミンによるプラスミドDNAの突然変異処理
12.マルチコピーサプレッサー
13.合成致死変異の取得

付録
 1 酵母実験でよく使われるベクター
 2 役立つウェブサイト一覧
 3 マスターシート