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バイオ実験イラストレイテッド③+

シリーズ:
細胞工学  > 細胞工学別冊
 |   細胞工学  > バイオ実験イラストレイテッド

細胞工学別冊  バイオ実験イラストレイテッド③+ 本当にふえるPCR

著:
中山広樹(京都大学医学部分子病診療学)
頁数:
228ページ
定価:
本体3,300円(税別)
発行年月:
1998年06月01日発行
ISBN_10:
4-87962-182-X
ISBN_13:
978-4-87962-182-5

読者より問合せの多かった「定量的PCR」の実際について新たな章を設け,標識の種類から定量用測定器の選択まで,注意点を含めて詳述していただきました.もちろん実際のプロトコールも豊富な図版を駆使して丁寧に紹介してあります.


第1章 PCRの原理と準備
1.PCRの原理
 PCRのカイネティクス
 カイネティクスから見たPCRの注意点
2.DNA増幅装置と反応容器
 マイクロチューブでの反応
 マイクロタイタープレートでの反応
 マイクロキャピラリーでの反応
 その他
3.酵素
 酵素の種類
 ユニット数
 酵素の失活
4.プライマー
 プライマーデザイン上の注意
 nestedプライマー
 Tm(meltingtemperature)
 オリゴヌクレオチドの定量
 オリゴヌクレオチド合成の基礎知識
 オリゴヌクレオチドの精製法
 コラム:ゲル濾過の謎
 オリゴヌクレオチド購入の際の注意
 (いろいろなパラメーターについて)
 オリゴヌクレオチドを取扱う上での注意点
5.その他の試薬
 バッファー
 dNTPミックス
 ミネラルオイル

第2章 PCRの基本プロトコール
1.反応温度・サイクル数の設定
 熱変性の温度と時間
 アニーリングの温度と時間
 伸長反応の温度と時間
 サイクル数
 代表的なサイクルの例
2.反応液の調製
 プライマー濃度
 デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の濃度
 酵素濃度
 鋳型DNA量
 反応系の容量
3.アガロースゲル電気泳動によるチェック
4.ポジティブコントロールとネガティブコントロール
 ネガティブコントロール
 ポジティブコントロール
 反応液を調製する順序
5.微量DNAサンプルの調製法-末梢血のgenotypingを例に
6.PCR
7.トラブルシューティング
 コラム:裏表のあるやつ・無神経なやつ-手袋の話
8.書き込み欄付PCR実験ノート

第3章 PCR生成物のサブクローニング
1.PCR生成物クローニングの問題点
2.サブクローニングの様々な方法
 ブラントエンドライゲーション
 制限酵素認識配列の付加
 コラム:TaqポリメラーゼのTdT活性
 ウラシルDNAグリコシラーゼを用いたクローニング
 TAクローニング
3.制限酵素認識配列の付加法
 ベクターの調製
 インサートの調製
 ライゲーション
4.TAクローニング法
 Tベクターの調製
 Tベクター用のインサートの調製
 ライゲーション
 TAクローニング法の注意事項
 一般的なサブクローニングへの応用
5.プラスミドインサートチェック
 プラスミドインサートチェックの原理
 実験例:コロニーからのダイレクトPCR
 制限酵素処理によるインサートチェック
 サブクローニングしたPCR生成物の向きの決定

第4章 RT-PCR法
1.RT-PCR法の原理
2.RT-PCR法のポイント
 ゲノムDNAのコンタミ
 1ststrandcDNA合成のプライマー
 RNAの除去
 AGPC法の変法によるRNA抽出
3.RT-PCR法の実際
 オリゴ(dT)を用いた1ststrandcDNA合成
 ランダムプライマーを用いた1ststrandcDNA合成
 PCR
4.ホットスタート法
 コラム:ホットスタートがゲノムDNAで有効な理由
 高温で酵素を加える
 PCR用固形ワックスの使用
 抗Taqポリメラーゼ抗体の使用

第5章 PCRを用いた未知遺伝子のクローニング
1.一般的な注意
 ネガティブコントロールを作る
 サイズ分画を行う
 得られた断片の判定法を持つ
2.3’RACE法
 3’RACE法の原理
 3’RACE法のポイント
 1ststrandcDNA合成(3’RACE法)
 PCR(3’RACE法)
3.5’RACE法
 5’RACE法の原理
 コラム:RNAリガーゼを用いた5’RACEの改良法
 5’RACE法のポイント
 1ststrandcDNA合成(5’RACE法)
 1ststrandcDNAの精製(5’RACE法)
 TdTによるホモポリマーの付加
 PCR(5’RACE法)
4.degeneratePCR法
 degeneratePCR法の原理
 degeneratePCR法のポイント
 得られたフラグメントの判定
5.AP-PCR法とDD法

第6章 PCRのシークエンスへの応用
1.サイクルシークエンス法の原理
2.サイクルシークエンス法の利点
3.サイクルシークエンス法の実際
 コラム:プラスミドはなぜシークエンスできるのか?
 プラスミドを鋳型としたサイクルシークエンス法
 PCR生成物を鋳型としたサイクルシークエンス法

第7章 PCRを用いた多型分析
1.PCRを用いたマイクロサテライト多型の検出
2.PCR-RFLP法
3.シークエンス
4.PCR-SSCP法
 SSCP法の原理
 SSCP法の注意点
 PCR-SSCP法の実際
5.PCR-CFLP法

第8章 定量的PCR
1.PCRのカイネティクス
2.競合的PCR法
 2組のプライマー対を使う方法
 同一のプライマー対を使う方法
3.カイネティクス分析法による定量
 カイネティクスから見たPCRの定量可能性
 カイネティクス分析の原理
4.CCDイメージアナライザーを用いた定量
 CCDイメージセンサーによる定量の予想される問題点
 モデル実験
 ノーザンハイブリダイゼーションとの比較
 カイネティクス分析法の応用

第9章 PCRを用いた定量の実際
1.内部標準
 定量的PCRで定量されるもの
 サンプル量を補正するための内部標準
 内部標準の具体例
2.定量に用いる測定器の条件
3.RIを用いた定量法
 RIによる核酸の検出法
 様々な測定器を用いたシグナル(放射活性)の定量
 コラム:写真フィルムの感光
4.RIを用いない定量法
 蛍光による核酸の検出法
 様々な測定器を用いたシグナル(蛍光)の検出
 コラム:手持ちの条件で定量的PCRを行うために
5.RIを用いた定量的PCRの具体例
 カイネティクス分析のためのRT-PCR
 液体シンチレーションカウンターを用いた定量
 イメージングプレートを用いた定量
6.RIを用いない定量的PCRの具体例
7.カイネティクス分析のためのデータ解析法
 測定のバックグラウンド
 カイネティクス分析
 分析結果の解釈
8.半定量法(簡便法)
9.カイネティクス分析法の展開